ainult teaduslikuks kasutamiseks
KASUTUSJUHEND

http://www.dldevelop.com

Hiire Huntingtin (HTT) ELISA komplekt
Katalooginumber: DLR-HTT-Mu
96 testid

AINULT UURINGUTE EEST; MITTE RAPUUTLIKUKS EGA DIAGNOSTILISTEKS RAKENDUSEKS!
PALUN LUGEGE ENNE ALUSTAMIST KOGU PROTSEDUUR LÄBI!

KASUTAMINE
Komplekt on võileiva-tüüpi ensüümimmunoanalüüs HTT in vitro kvantitatiivseks mõõtmiseks hiire seerumis, plasmas, koehomogenaatides, rakulüsaatides, rakukultuuri supernatantides või muudes bioloogilistes vedelikes.

Pakutud reaktiivid ja materjalid

Reaktiivid	Kogus	Reaktiivid	Kogus
Eelnevalt kaetud, kasutusvalmis 96-süvendiga ribaplaat	1	96 süvendiga plaatide tihendaja	2
Standardne	2	Standardne lahjendi	1 × 20 ml
Detekteerimislahus A	1 × 12 ml	TMB substraat	1 × 9 ml
Detekteerimislahus B	1 × 12 ml	Lõpeta lahendus	1 × 6 ml
Pesupuhver (30 × kontsentraat)	1 × 20 ml	Kasutusjuhend	1

NÕUTAVAD MATERJALID, MIDA TARNIMATA

1. Mikroplaadilugeja 450 ± 10 nm filtriga.
2. Täppis-ühe- või mitmekanalilised pipetid ja ühekordsed otsikud.
3. Eppendorfi tuubid lahustamiseksampvähem.
4. Deioniseeritud või destilleeritud vesi.
5. Imav paber mikrotiiterplaadi blotimiseks.
6. Pesulahuse konteiner.

KOMPLEKTIDE SÄILITAMINE

1. Avamata komplektide puhul: kõiki reagente tuleb kättesaamisel hoida temperatuuril -20 °C.
2. Avatud komplektide puhul: Pärast komplekti avamist tuleb ülejäänud reagente säilitada vastavalt ülaltoodud säilitustingimustele. Lisaks pange kasutamata süvendid tagasi kuivatusainepakendit sisaldavasse fooliumkotti ja sulgege kile uuesti kogu serva ulatuses.

Märkus.
Komplekti aegumiskuupäeva vaata komplekti karbil olevalt etiketilt. Kõik komponendid on stabiilsed kuni selle aegumiskuupäevani.
Ülejäänud reagendid on tungivalt soovitatav ära kasutada 1 kuu jooksul pärast avamist.

SAMPLE KOGUMINE JA LADUSTAMINE

• Seerum – Kasutage seerumi eraldustoru ja laskeampLaske verel hüübida kaks tundi toatemperatuuril või üleöö temperatuuril 4 °C enne tsentrifuugimist 20 minutit kiirusel umbes 1000 × g. Analüüsige värskelt valmistatud seerumit kohe või säilitageampHoida alikvootidena temperatuuril -20 °C või -80 °C hilisemaks kasutamiseks. Vältida korduvaid külmutamise/sulatamise tsükleid.
• Plasma – Koguge plasma, kasutades antikoagulandina EDTA-d või hepariini. TsentrifuugigeampLase plasmal 15 minutit kiirusel 1000 × g temperatuuril 2–8 °C 30 minuti jooksul pärast proovi võtmist. Eemalda plasma ja analüüsi koheselt või säilitaampHoida alikvootidena temperatuuril -20 °C või -80 °C hilisemaks kasutamiseks. Vältida korduvaid külmutamise/sulatamise tsükleid.
• Koehomogenaadid – Koehomogenaatide valmistamine varieerub olenevalt koetüübist. Selle analüüsi jaoks tuleks koed loputada jääkülmas PBS-is (0.01 mol/l, pH 7.0–7.2), et eemaldada liigne veri, ja kaaluda need enne homogeniseerimist. Hakkige koed väikesteks tükkideks ja homogeniseerige need 5–10 ml PBS-is klaasist homogenisaatoriga jääl (sobivad ka mikrokoeveskid). Saadud suspensiooni tuleks ultraheliga töödelda rakkude lõhkujaga või allutada kahele külmutamise-sulatamise tsüklile, et rakumembraane veelgi lõhkuda. Pärast seda tsentrifuugitakse homogenaate 5 minutit kiirusel 5000 × g. Eemaldage supernatant ja analüüsige kohe või jagage alikvootideks ja hoidke temperatuuril ≤ –20 °C.
• Rakulüsaadid – rakud tuleb enne analüüsimist lüüsida vastavalt järgmistele juhistele.

1. Kleepunud rakud tuleks trüpsiiniga eraldada ja seejärel tsentrifuugimise teel koguda (suspensioonirakke saab otse tsentrifuugimise teel koguda).
2. Peske rakke kolm korda külmas PBS-is.
3. Resuspendeerige rakud PBS-is (1×) ja töödelge rakke ultraheliga 4 korda (või külmutage rakud temperatuuril ≤ -20 °C. Sulatage rakud õrnalt segades. Korrake külmutamise/sulatamise tsüklit 3 korda).
4. Tsentrifuugige 1500 × g juures 10 minutit temperatuuril 2–8 °C, et eemaldada rakujäägid.
    Rakukultuuri supernatant või muud bioloogilised vedelikud – tsentrifuugidampLase 20 minutit kiirusel 1000 × g. Eemalda osakesed ja analüüsi kohe või säilitaampalikvootidena temperatuuril -20 °C või -80 °C. Vältige korduvaid külmutamise/sulatamise tsükleid.

REAGENDI ETTEVALMISTAMINE

1. Kaasa kõik komplekti komponendid ja sampEnne kasutamist laske toatemperatuurini (18–25 °C) jõuda.
2. Standardlahus – lahustage standardlahus 1.0 ml standardlahjendiga, hoidke 10 minutit toatemperatuuril ja loksutage õrnalt (mitte vahutamiseks).
   Standardlahuse kontsentratsioon põhilahuses on 10 ng/ml. Valmistage ette 7 katseklaasi, mis sisaldavad 0.5 ml standardlahjendit, ja kasutage lahjendatud standardit kahekordse lahjenduse seeria valmistamiseks vastavalt allolevale pildile. Segage iga katseklaasi enne järgmist ülekannet hoolikalt.
   Valmistage 7-punktiline lahjendusseeria; näiteksample: 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml, 0.625 ng/ml, 0.312 ng/ml, 0.156 ng/ml ja viimane EP-katsuti standardlahjendiga on pimekatseks kontsentratsioonil 0 ng/ml.
3. Detekteerimislahus A ja detekteerimislahus B – Detekteerimislahused A ja B on juba õiges kontsentratsioonis ja neid pole vaja edasi lahjendada.
4. Pesulahus – 600 ml pesulahuse (1×) valmistamiseks lahjendage 20 ml pesulahuse kontsentraati (30×) 580 ml deioniseeritud või destilleeritud veega.
5. TMB substraat – Aspireerige vajalik annus lahust steriliseeritud otsikutega. Ärge valage järelejäänud lahust tagasi viaali.

Märkus.

1. Ärge tehke seeriaviisilist lahjendust otse süvendites.
2. Valmistage standardlahus 15 minuti jooksul pärast analüüsi tegemist.
3. Standardid lahustatakse ettevaatlikult vastavalt juhistele, vältides vahutamist, ja segatakse õrnalt, kuni kristallid on täielikult lahustunud.
4. Taastatud standardeid saab kasutada ainult üks kord.
5. Kui pesulahuse kontsentraadis (30×) on moodustunud kristallid, soojendage seda toatemperatuurini ja segage õrnalt, kuni kristallid on täielikult lahustunud.
6. Reaktiivi ettevalmistamisel kasutatud saastunud vesi või anum mõjutab tuvastustulemusi.

SAMPLE ETTEVALMISTAMINE

1. DL Sci & Tech Development Co.,Ltd. vastutab ainult komplekti enda, mitte selle sisu eest.amptarbitakse testi ajal vähem. Kasutaja peaks arvutama s-i võimaliku suuruseampkogu testis vähem kasutatud.
   Palun reserveerida piisavalt samples ette.
2. Enne analüüsimist ennustage kontsentratsiooni. Kui nende väärtused ei jää standardkõvera vahemikku, peavad kasutajad määrama optimaalsed samplahjendused nende konkreetsete katsete jaoks. SampLahjendada tuleks komplektis sisalduva standardlahjendiga. Kui komplektis olevast standardlahjendist ei piisa, sampNeid saab lahjendada ka 0.01 mol/L PBS-iga (pH 7.0–7.2).
3. Kui sampKui juhendis ei ole näidatud, on komplekti kehtivuse kindlakstegemiseks vajalik eelkatse.
4. Kudede või rakkude ekstraheerimine sampKeemilise lüüsipuhvriga valmistatud proovid võivad teatud kemikaalide mõju tõttu põhjustada ootamatuid ELISA tulemusi.
5. Kuna meie komplektides kasutatavate antikehade ja teist päritolu antigeenide vahel võib esineda mittevastavust (nt antikeha sihib konformatsioonilist epitoopi, mitte lineaarset epitoopi), ei pruugi meie tooted ära tunda mõningaid teiste tootjate natiivseid või rekombinantseid valke.
6. SampKomplekt ei pruugi tuvastada rakukultuuri supernatantist pärinevaid baktereid selliste tegurite mõjul nagu rakkude elujõulisus, rakkude arv ja/või samplingu aeg.
7. Värske sampTesti jaoks on soovitatav kasutada kudesid, mida pole pikka aega säilitatud. Vastasel juhul võib neis kudesid valgud laguneda ja denaturaliseeruda.ampja annavad ebatäpseid või valesid tulemusi.

ANALÜÜSI MENETLUS

1. Määrake lahjendatud standardi, pimekatse ja s jaoks süvendid.ampe. Valmistage standardite jaoks ette 7 süvendit ja 1 süvend pimekatse jaoks. Lisage 100 μL igast standardi (vt reagendi ettevalmistamine), pimekatse ja s lahjendusest.ampValage sobivatesse süvenditesse. Katke plaadi sulguriga. Inkubeerige 90 minutit temperatuuril 37 °C.
2. Eemaldage vedelik igast süvendist.
3. Lisage igasse süvendisse 100 μl tuvastuslahust A. Pärast plaadi sulguriga katmist inkubeerige 45 minutit temperatuuril 37 °C.
4. Imege lahus välja ja peske igasse süvendisse 300 μl 1× pesulahusega, kasutades pritspudelit, mitmekanalilist pipetti, kollektordosaatorit või automaatpesurit, ja laske sel 1-2 minutit seista. Eemaldage ülejäänud vedelik kõigist süvenditest täielikult, koputades plaati imavale paberile.
   Peske plaati hoolikalt 3 korda. Pärast viimast pesu eemaldage järelejäänud pesupuhver aspireerimise või dekanteerimise teel. Pöörake plaat ümber ja kuivatage seda imava paberi vastu.
5. Lisage igasse süvendisse 100 μl tuvastuslahust B. Inkubeerige pärast plaadi sulguriga katmist 45 minutit temperatuuril 37 °C.
6. Korda aspiratsiooni/pesuprotsessi kokku 5 korda, nagu on kirjeldatud 4. etapis.
7. Lisage igasse süvendisse 90 μL substraadilahust. Katke uue plaadi sulguriga. Inkubeerige 15–25 minutit temperatuuril 37 °C (mitte üle 30 minuti). Hoida valguse eest kaitstult. Substraadilahuse lisamisel muutub vedelik siniseks.
8. Lisage igasse süvendisse 50 μl stopp-lahust. Stopp-lahuse lisamisel muutub vedelik kollaseks. Segage vedelikku, koputades plaadi küljele. Kui värvimuutus ei tundu ühtlane, koputage plaati õrnalt, et tagada täielik segunemine.
9. Eemalda plaadi põhjalt veetilgad ja sõrmejäljed ning veendu, et vedeliku pinnal pole mulle. Käivita mikroplaadilugeja ja tee kohe mõõtmised lainepikkusel 450 nm.

Märkus.

1. Analüüsi ettevalmistamine: Hoidke iga katse jaoks sobiv arv süvendeid ja eemaldage mikrotiiterplaadilt liigsed süvendid. Ülejäänud süvendid tuleb uuesti sulgeda ja säilitada temperatuuril -20 °C.
2. SampReagentide lisamine: palun kasutage värskelt valmistatud standardit. Lisage ettevaatlikult lahust.ampLisage reagente süvenditesse ja segage õrnalt, et vältida vahutamist. Ärge puudutage süvendi seinu. Protseduuri iga etapi jaoks on reagentide või lahustite lisamiseks kuluv koguannusampLisandite lisamine analüüsiplaadile ei tohiks kesta kauem kui 10 minutit. See tagab iga pipeteerimisetapi võrdse aja ilma katkestusteta. Kõigi standardite ja proovide dubleerimine on soovitatav, kuigi mitte kohustuslik. Ristsaastumise vältimiseks vahetage pipetiotsi standardite lisamise vahel.ampja reagendid. Lisaks kasutage iga reagendi jaoks eraldi reservuaari.
3. Inkubatsioon: Täpsete tulemuste tagamiseks on oluline plaaditihendite korralik nakkumine inkubatsioonietappide ajal. Ärge laske süvenditel inkubatsioonietappide vahel pikka aega katmata seista. Kui reagendid on süvendiribadele lisatud, ÄRGE laske ribadel analüüsi käigus kuivada. Inkubatsiooniaega ja temperatuuri tuleb kontrollida.
4. Pesemine: Pesemisprotseduur on kriitilise tähtsusega. Hea tulemuse saavutamiseks on oluline igas etapis vedeliku täielik eemaldamine. Pärast viimast pesu eemaldage järelejäänud pesulahus aspireerimise või dekanteerimise teel ning eemaldage plaadi põhjalt kõik veetilgad või sõrmejäljed. Ebapiisav pesemine põhjustab halba täpsust ja vale kõrgenenud neeldumisnäitaja.
5. Reaktsiooniaja kontrollimine: Jälgige värvimuutust pärast TMB substraadi lisamist (nt jälgige iga 10 minuti järel). Kui värvus on liiga tume, lisage eelnevalt stopplahus, et vältida liiga tugevat reaktsiooni, mis võib põhjustada ebatäpset neeldumisnäitu.
6. TMB substraat saastub kergesti. Palun kaitske seda valguse eest.
7. Keskkonna niiskustase võib mõjutada komplektiga saadud tulemusi. Kui teie asutuse õhuniiskus on alla 60%, on soovitatav kasutada niisutajat.

TESTIMISE PÕHIMÕTE
Selles komplektis olev mikrotiiterplaat on eelnevalt kaetud HTT-spetsiifilise antikehaga. Standardid võiampSeejärel lisatakse mikrotiiterplaadi sobivatesse süvenditesse mädarõika peroksidaasiga (HRP) konjugeeritud biotiiniga konjugeeritud antikehade preparaat. Seejärel lisatakse igasse mikrotiiterplaadi süvendisse mädarõika peroksidaasiga (HRP) konjugeeritud avidiin ja inkubeeritakse. Pärast TMB substraadi lahuse lisamist ilmneb ainult nendes süvendites, mis sisaldavad HTT-d, biotiiniga konjugeeritud antikeha ja ensüümiga konjugeeritud avidiini.
värvuse muutus. Ensüümi-substraadi reaktsioon peatatakse väävelhappe lahuse lisamisega ja värvuse muutust mõõdetakse spektrofotomeetriliselt lainepikkusel 450 nm ± 10 nm. HTT kontsentratsioon sampSeejärel määratakse les, võrreldes s-i OD-dampstandardkõverale.

TULEMUSTE ARVUTAMINE

Keskmistage iga standardi, kontrolli ja standardproovi duplikaatnäidud.ample, seejärel lahutage keskmine nullstandardi optiline tihedus. Koostage standardkõver, joonistades iga standardi keskmise optilise tiheduse ja kontsentratsiooni ning joonistades graafiku punktide kaudu parima sobivusega kõvera või looge standardkõver log-log graafikpaberile, kus HTT kontsentratsioon on y-teljel ja neelduvus x-teljel. Soovitatav on kasutada ka graafiku koostamise tarkvara (näiteks curve expert 1.30). Kui sampKui on lahjendatud, tuleb standardkõveralt loetud kontsentratsioon korrutada lahjendusteguriga.

TÜÜPILISED ANDMED

Arvutuse lihtsustamiseks joonistame standardi optilise tiheduse väärtuse (X-telg) standardi teadaoleva kontsentratsiooni (Y-telg) suhtes, kuigi kontsentratsioon on sõltumatu muutuja ja optilise tiheduse väärtus on sõltuv muutuja. Standardkõvera optilise tiheduse väärtused võivad aga varieeruda sõltuvalt analüüsi läbiviimise tingimustest (nt operaator, pipeteerimistehnika, pesutehnika või temperatuuri mõju), mistõttu on soovitatav iga testi jaoks standardkõvera loomiseks andmete logi joonistada.
Allolev tüüpiline standardkõver on esitatud ainult viitamiseks.

TUVASTUSVALDKOND
0.156–10 ng/ml. ELISA-de jaoks kasutatud standardkõvera kontsentratsioonid olid 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2.5 ng/ml, 1.25 ng/ml, 0.625 ng/ml, 0.312 ng/ml ja 0.156 ng/ml.

TUNDLIKKUS
HTT minimaalne tuvastatav annus on tavaliselt alla 0.055 ng/ml.
Selle testi tundlikkus ehk alumine avastamispiir (LLD) defineeriti kui madalaim valgu kontsentratsioon, mida oli võimalik nullist eristada. See määrati, lisades kahekümne nullstandardi replikaadi keskmisele optilise tiheduse väärtusele kaks standardhälvet ja arvutades vastava kontsentratsiooni.

SPETSIFIKATSIOON
Sellel testil on HTT tuvastamiseks kõrge tundlikkus ja suurepärane spetsiifilisus.
HTT ja analoogide vahel olulist ristreaktiivsust ega interferentsi ei täheldatud.
Märkus.
Praeguste oskuste ja teadmiste piires on võimatu läbi viia kõiki võimalikke ristreaktiivsuse tuvastamise teste HTT ja kõigi analoogide vahel, seega võib ristreaktiivsus siiski esineda.

TÄPSUS
Testisisene täpsus (täpsus testis): 3 sampMadala, keskmise ja kõrge HTT-tasemega rakke testiti vastavalt 20 korda ühel plaadil.
Analüüsidevaheline täpsus (täpsus analüüside vahel): 3 sampMadala, keskmise ja kõrge HTT-tasemega rakke testiti kolmel erineval plaadil, igal plaadil 8 kordust.
CV(%) = standardhälve/keskmine × 100
Siseanalüüs: variatsioonikordaja <10%
Analüüsidevaheline: variatsioonikordaja < 12%

STABIILSUS
ELISA komplekti stabiilsust määrab aktiivsuse kao määr. Sobivate säilitustingimuste korral on selle komplekti kao määr kõlblikkusaja jooksul alla 5%.
Märkus.
Toimivusele ebavajalike mõjude minimeerimiseks tuleks rangelt reguleerida tööprotseduure ja laboritingimusi, eriti toatemperatuuri, õhuniiskust ja inkubaatori temperatuuri. Samuti on tungivalt soovitatav, et kogu testi viiks algusest lõpuni läbi sama eksperimentaator.

ANALÜÜSI MENETLUSE KOKKUVÕTE

1. Valmistage ette kõik reagendid, sampja standardid;
2. Lisage 100 µl standardit võiample igasse süvendisse. Inkubeerige 90 minutit temperatuuril 37 °C;
3. Aspireerige ja lisage 100 µl tuvastuslahust A. Inkubeerige 45 minutit temperatuuril 37 °C;
4. Aspireerige ja peske 3 korda;
5. Lisage 100 µl tuvastuslahust B. Inkubeerige 45 minutit temperatuuril 37 °C;
6. Aspireerige ja peske 5 korda;
7. Lisage 90 µl substraadilahust. Inkubeerige 15–25 minutit temperatuuril 37 °C;
8. Lisa 50 µl stopplahust. Loe kohe 450 nm juures.

OLULISED MÄRKUSED

1. Praeguste tingimuste ja teadusliku tehnoloogia tõttu ei ole tarnijate poolt tarnitud toorainete põhjalikke identifitseerimis- ja analüüsikatseid võimalik läbi viia. Seetõttu on võimalik, et esineb kvalitatiivseid ja/või tehnilisi riske.
2. Lõplikud eksperimentaalsed tulemused on tihedalt seotud toodete kehtivuse, lõppkasutajate kasutusoskuste ja eksperimentaalse keskkonnaga. Palun veenduge, et oleks piisavalt infot.ampTäpsete tulemuste saamiseks on saadaval vahendid.
3. Erinevate partiide komplektid võivad tuvastusvahemiku, tundlikkuse ja värvi ilmutamise aja poolest veidi erineda. Palun tehke katse täpselt vastavalt komplektiga kaasasolevale kasutusjuhendile. Elektroonilised komplektid meie veebilehel. websaidi andmed on ainult viitamiseks.
4. Ärge segage ega asendage ühe partii reagente teisega. Kasutage ainult tootja poolt tarnitud reagente.
5. Kaitske kõiki reagente säilitamise ja inkubeerimise ajal tugeva valguse eest. Kõik reagentide pudelikorgid tuleb tihedalt sulgeda, et vältida vedelike aurustumist ja mikroorganismidega saastumist.
6. Plaadi esmakordsel avamisel võib süvendites olla udune aine. See ei mõjuta lõplikke analüüsi tulemusi. Ärge eemaldage mikrotiiterplaati säilituskotist enne, kui see on vajalik.
7. Reaktiivi ettevalmistamise ja laadimise valed protseduurid, samuti plaadilugeja vale parameetrite seadistamine võivad põhjustada valesid tulemusi. Neeldumise mõõtmiseks sobib mikroplaadilugeja ribalaiusega kuni 10 nm ja optilise tiheduse vahemikuga 0–3 OD või suurem lainepikkusel 450 ± 10 nm. Palun lugege enne katset hoolikalt juhiseid ja seadistage seade.
8. Isegi sama eksperimentaator võib kahest eraldi katsest saada erinevaid tulemusi. Paremate reprodutseeritavate tulemuste saamiseks tuleks testi iga etapi toimimist kontrollida. Lisaks on soovitatav enne iga partii üldist testi teha eelkatse.
9. Iga komplekt on läbinud mitu ranget kvaliteedikontrolli testi. Lõppkasutajate tulemused võivad aga ootamatute transporditingimuste või erinevate laboriseadmete tõttu meie sisemiste andmetega erineda. Erinevate partiide komplektide analüüsisisene varieeruvus võib samuti tuleneda ülaltoodud teguritest.
10. Erinevate tootjate komplektid sama tootega võivad anda erinevaid tulemusi, kuna me ei ole oma tooteid teiste tootjatega võrrelnud.
11. Selle komplekti standardiks, nagu ka antikehade valmistamisel kasutatavad antigeenid, on tavaliselt rekombinantsed valgud. Rekombinantsete valkude valmistamisel saab kasutada erinevalt ekspresseeritud järjestusi, ekspressioonisüsteeme ja/või puhastusmeetodeid. Samuti on võimalik, et meie komplektides olevate antikehade ja antikehapaaride skriiningutehnikas esineb erinevusi. Seetõttu ei saa me garanteerida, et meie komplekt suudab tuvastada teiste ettevõtete toodetud rekombinantseid valke. Me EI SOOVITA meie ELISA komplekte kasutada teiste rekombinantsete valkude tuvastamiseks.
12. Kehtivusaeg: 16 kuud.
13. Kasutusjuhend töötab ka 48T komplektiga, kuid kõigi 48T komplektis olevate reagentide kogus on poole võrra väiksem.

ETTEVAATUST
Selle komplektiga kasutamiseks soovitatav stopplahus on happelahus. Selle reagendi kasutamisel kandke silmade, käte, näo ja riiete kaitset.

Dokumendid / Ressursid

DEVEL DLR-HTT-Mu hiire Huntingtin ELISA komplekt [pdfKasutusjuhend AAA23957, DLR-HTT-Mu hiire Huntingtini ELISA komplekt, DLR-HTT-Mu, hiire Huntingtini ELISA komplekt, Huntingtini ELISA komplekt, ELISA komplekt, komplekt

Viited

• Kasutusjuhend